1、仪器与试剂

　　HP1100型高效液相色谱仪，G1315A DAD 二极管阵列检测器，G1313A ALS自动进样器;SUPELCO DISCOVERY C185μm 250×4.6mm色谱柱。固相萃取小柱为ZORBAX SPE C18Cart。12头固相萃取真空富集装置(Alltech Scientific Limited)。超声波清洗器KS—500D，超速离心机Gl-25M，搅肉机，涡旋混合器。甲醇(色谱纯)，磷酸二氢钠(分析纯)，EDTA(分析纯)，高氯酸溶液(优级纯)、硝酸(优级纯)。土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准品(SIGMA公司)。

　　2、高效液相色谱分析条件

　　色谱柱为SUPELCO DISCOVERY C185μm 250×4.6mm，流动相为0.O1mol/L磷酸二氢钠+0.001 mol/L EDTA:甲醇=60:40(V/V，pH=2.0)，流速为0.8ml/min，检测波长为268nm柱温为25℃，进样量为20μl。

　　3、实验方法

　　(1)土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准储备液的配制

　　分别称取O.0100mg土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准品置于4个1Oml容量瓶中，分别加入甲醇溶解并定容至刻度，此溶液浓度分别为1.00mg/ml，置于冰箱冷藏室保存。

　　(2)混合标准中间液的配制

　　分别吸取土霉素、四环素标准储备液各1.00ml，金霉素、氯霉素标准储备液各 2.00m1.置于100ml容量瓶中，用流动相A液定容至刻度，此溶液浓度分别为：土霉素(10μg/m1)、四环素(10μg/m1)、金霉素(20μg/m1)、氯霉素(20μg/m1)，置于冰箱冷藏室保存。

　　(3)标准使用液的配制

　　准确吸取混合标准中间液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、 8.0、10.0ml分别置于1Oml容量瓶中，用流动相A液定容至刻度，得到的标准系列为：0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、 8.0、10.0μg/m1(土霉素、四环素);0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/m1(金霉素、氯霉素)。

　　(4)流动相A液的配制

　　0.01mol/L磷酸二氢钠+0.001mol/L EDTA，用30%硝酸调至pH=2.0，经0.45μm双层水系滤膜过滤。

　　(5)流动相B液的配制

　　0.01mol/L磷酸二氢钠，用30%硝酸调至pH=2.0，经0.45μm双层水系滤膜过滤。

　　(6)样品前处理

　　准确称取5.00g搅碎的水产品于5Oml带盖的塑料离心管中，加入20%高氯酸溶液 15ml，涡旋1min，将此离心管放入超声波清洗器中提取20min后，用离心机离心10min，收集上清液于25ml容量瓶中，往残渣中加入1Oml 2%高氯酸溶液，用玻棒搅动使样品均匀分散于高氯酸溶液中，将此离心管放入超声波清洗器中提取20min后，用离心机离心10min，收集上清液于上述 25ml容量瓶中，合并两次上清液，用2%高氯酸溶液定容，取该提取液1O ml经已调节的固相萃取小柱吸附，用10%甲醇水2ml冲洗固相萃取小柱，用50%甲醇水1ml洗脱后收集备用。

　　(7)样品测定