矛尾复虾虎鱼病原哈氏弧菌的鉴定及特异性检测方法的研究

摘 要：2009 年 8 至 9 月间，江苏赣榆县多家虾蟹养殖塘混养的矛尾复虾虎鱼大量死亡，主要病变特征为体表出血、肌肉溃疡，从矛尾复虾虎鱼深层溃烂组织及肝脏中分离出优势菌，通过感染实验表明了该菌对矛尾复虾虎鱼有很强的致病性，当分离菌浓度在 106 至 108 可引起矛尾复虾虎鱼全部死亡。对分离菌进行相关的形态及理化特性等生物学特性检验，分析了 16S rRNA 和 gyrB 两种基因序列的同源性，并采用 PAUP4.0 的最大简约法maximum parsimony，MP构建了基于两种基因的 MP 系统发生树，结果表明引起矛尾复虾虎鱼大量死亡的病原为弧菌属Vibrio的哈氏弧菌Vibrio harveyi。同时基于 gyrB 基因和 toxR 基因序列各设计了 1 对特异性引物，接着利用该两对引物进行 PCR 扩增和敏感性检测，最后进行海产品的检验，建立了一种哈氏弧菌快速、 在 敏感的 PCR 检测方法。 PCR扩增中，gyrB 基因引物 A2B3 扩增目的片段大小为为 363bp，该方法最低能检测0.0046875ng/μL 哈氏弧菌模板 DNA；toxR 基因引物 vh-tox-F、vh-tox-R 扩增目的片段大小为为 390bp，该方法最低能检测 0.75ng/μL 哈氏弧菌模板 DNA。基于哈氏弧菌的 gyrB 基因和 toxR 基因建立的 PCR 检测技术在对由哈氏弧菌所引起的流行病的调查具有重要意义。

    矛尾复虾虎鱼（Synechogobius hasta）分类于鲈形目（Perciformes）、虾虎鱼科（Gobiidae）、复虾虎鱼属，俗称胖头鱼、海鲇鱼、扔巴鱼，暖温性中小型底层杂食性鱼类，耐温性和耐盐性超强。矛尾复虾虎鱼体延长，前部亚圆柱形，尾部侧扁。它的头大，略扁平状；吻中长，圆钝；口裂大，下颌微突出，齿小而细密；眼小，上侧位，眼间隔宽平；体被圆鳞，尾部鳞大；背鳍两个，相互分离；复鳍发育成吸盘状，能固定于海床上，尾鳍尖长。它的体表黄褐色，有不规则暗淡斑纹，体色随栖息环境不同有所差异；腹部色浅，性成熟期呈淡黄色，复鳍泛红。一般个体体长 25cm-30 cm，尾重 150g-200g，最大个体长可达 50cm 以上，尾重超过 500g。它们为暖温性大型虾虎鱼类的一种，分布于我国渤海、东海和朝鲜、日本沿岸及河口附近泥质海区。它们以沙蚕、白虾、鼓虾和大眼蟹为主食亦摄食小型虾虎鱼、青鳞等仔、稚鱼

1。近年来随着养殖业的发展，养殖矛尾复虾虎鱼户逐渐增多，由于多种原因的共同影响，如药物的滥用，底质逐步老化，水域生态环境日趋恶化，加上管理措施不当，使得鱼病不断爆发。病鱼表现为身体发黄发瘦，弯曲成弓形，体表有大小不一的溃烂面，肠道内化脓结节，许多内部器官也发生肉眼可见的病变2。鱼病引起的鱼的死亡率达 70％以上，这给养殖户带来了不可挽回的经济损失。 2009 年 8 至 9 月间，江苏连云港赣榆县多家虾蟹养殖塘混养的矛尾复虾虎鱼大量死亡，主要病变特征为体表出血，肌肉溃疡。我们从矛尾复虾虎鱼中深层溃烂组织及肝脏中分离到一种优势生长菌，然后对其进行生理生化和分子学鉴定，分析了 16S rRNA 和 gyrB 两种基因序列的同源性，并采用 PAUP4.0 的最大简约法maximum parsimony，MP构建了基于两种基因的 MP 系统发生树，结果表 明 引起矛尾复虾虎鱼大量死亡的病原为弧菌属Vibrio的哈氏弧菌Vibrioharveyi Johnson and Shunk 1936；同时，以哈氏弧菌 gyrB 基因和 toxR 基因设计特异性引物，进行 PCR 检测和敏感性试验，建立哈氏弧菌特异性分子生物学检测方法。

2 材料和试剂2.1 仪器与设备 仪器：数码显微镜，型号为 DMD5-5，生产厂家为日本尼康公司；电泳仪型号为 DYY-2C，生产厂家为北京市六一仪器；水平凝胶电泳槽型号为 DYCP-31BN，生产厂家为北京市六一仪器厂；常规 PCR 扩增仪型号为 TGradient，生产厂家为德国 Biometra 公司双人单面净化工作台型号为 SW-CJ-2FD，生产厂家为苏州净化微波炉型号为 P7021TP-6，生产厂家为中国 Galanz；立式压力蒸汽灭菌器筒，型号为 01J203-04，生产厂家上海东亚压力容器制造有限公司；恒温摇床，型号为 QYC 2102C，生产厂家为上海福玛实验设备有限公司；电子天平，型号为 EL104，生产厂家为梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；冷藏冷冻箱，型号为 BCD-206TDZA，生产厂家为青岛海尔股份有限公司；生化培养箱，型号为 SPX-250B-Z 型，生产厂家为上海博迅实业有限公司医疗设备厂；台式高速离心机，型号为 TG16A-WS，生产厂家为上海卢湘离心机仪器有限公司

 更多详情资料 http://www.doc88.com/p-0651660028680.html  访问该链下载